단일세포 및 초저입력 RNA-Seq

단일세포 RNA 시퀀싱은 개별 세포 수준에서 유전자 발현을 프로파일링하는 데 사용되어, 복잡한 세포 표현형에 대한 고해상도 보기를 가능하게 합니다. 이 방법은 단일 세포 수준에서 세포 이질성과 유전자 발현의 동적 변화를 발견합니다.¹

scRNA-Seq은 암 연구, 면역학 및 자가면역, 줄기세포 생물학, 발달 생물학 및 신경과학을 포함한 기본 연구, 중개 연구 및 임상 연구 분야에 걸쳐 광범위한 유용성을 가지고 있습니다. 이러한 강력한 방법은 이질적인 세포 군집(heterogeneous cell population)을 연구하고 희귀 세포 유형을 발견하며 세포 레벨에서 질병 및 발달 과정의 특징을 확인하는 데 사용됩니다.^1,2

벌크 RNA-Seq 접근법과 달리, 단일세포 RNA-Seq는 고도로 이질적인 세포 집단 내에서 주어진 세포에 대한 상세한 전사 프로파일을 제공합니다. 이러한 수준의 해상도는 종양을 포함한 복잡한 조직 또는 면역세포 집단에서 특히 중요합니다. 또한, 단일세포 RNA-Seq는 희귀하고 풍부도가 낮은 전사체를 검출하고, 새로운 전사체 동형 및 조절 기전을 식별하며, 질병 병리생물학을 더 잘 이해할 수 있는 민감한 방법입니다.

단일세포 RNA 시퀀싱은 각 세포에서 발현되는 유전자, 전사체 시그니처에 기반해 세포 표현형이 어떻게 다른지, 그리고 유전자 발현이 환경, 질병 과정, 치료에 의해 어떻게 영향을 받는지 밝혀내 세포 동일성과 기능에 대한 고해상도 스냅샷을 제공합니다. 예를 들어, 단일세포 RNA 시퀀싱을 사용하여 전사 시그니처를 통해 특정 면역 세포 아집단을 식별 및 특성을 확인하고 가능한 세포 운명 결정을 밝혀낼 수 있습니다.³

기술적인 문제와 생물학적 요인으로 인해 단일세포 RNA 시퀀싱 데이터는 벌크 RNA 시퀀싱에 비해 잡음과 복잡성이 더 많은 것으로 보고됩니다. scRNA-Seq 데이터의 변동성이 크면 전산 분석과 데이터 해석이 어려울 수 있습니다.⁴ 또한 제한된 스케일링, 높은 시약 비용 및 특수 자본 장비에 대한 요구로 인해 단일세포 RNA 시퀀싱의 광범위한 채택이 느려졌습니다.

 Illumina Single Cell 3' RNA Prep 키트 가 값비싼 미세유체 장비 또는 복잡한 워크플로우 없이 단일세포 mRNA 캡처, 바코드 및 라이브러리 준비를 지원하는 방법을 알아보세요.

PIPseq chemistry는 확장 가능하고 간단한 단일세포 RNA 캡처 및 바코딩을 가능하게 합니다. PIP은 particle-templated instant partition의 약자로, 하이드로겔 비드(hydrogel bead) 결합 후 바코드가 부착된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 포함하는 템플릿 입자를 사용해 유화(emulsification)를 진행하는 assay입니다. 샘플 준비 단계에서 관심 세포 현탁액(cell suspension)이 템플릿 입자 및 오일과 혼합된 후 볼텍싱을 통해 템플릿화된 유화액(emulsion)으로 분리됩니다. 유화액 내 세포가 용해되면, 바코드가 부착된 템플릿이 mRNA를 포획합니다. 이후 유화액이 분해되고 포획된 mRNA에서 역전사(reverse transcription) 과정을 통해 cDNA가 생성되며 증폭(amplification)을 거치면 각각의 세포에 대한 cDNA 라이브러리가 만들어집니다. 그 다음 단일세포 cDNA 라이브러리는 일반적인 라이브러리 준비 방법을 사용해 시퀀싱 라이브러리로 처리된 후 NGS 분석이 진행됩니다.

scRNA-Seq 애플리케이션을 위한 PIPseq chemistry의 사용에 대해 자세히 알아보거나 Illumina Single Cell 3' RNA Prep Kit 페이지를 살펴보세요.

최적의 시퀀싱 깊이는 RNA 함량이 다양한 샘플 유형, 원하는 실험 결과 및 시퀀싱 플랫폼의 처리량 기능을 포함한 다양한 요인에 따라 달라집니다.
Illumina Single Cell 3’ RNA Prep 키트의 경우, 샘플 유형 전반에서 캡처 효율성의 변동성으로 인해 캡처된 셀의 예상 수가 아닌 입력 셀당 리드(RPIC)를 사용하여 권장 시퀀싱 리드 뎁스를 계산합니다.

자세한 내용은 단일세포 RNA 준비 FAQ 및 리소스 페이지를 참조하세요.

단일세포 RNA 시퀀싱에 권장되는 세포의 수는 실험 목표와 어떤 방법을 원하는지에 따라 다릅니다. Illumina Single Cell 3’ RNA Prep 키트의 경우, 단일세포 RNA 시퀀싱에 약 100~200,000개의 세포가 권장됩니다.

자세한 내용은 간소화된 워크플로우 및 사양 표가 포함된 Illumina Single Cell 3' RNA Prep Kit 페이지를 참조하세요.

단일세포 RNA 시퀀싱은 신선, 냉동 또는 DSP-메탄올 고정 세포와 핵뿐만 아니라 다양한 종의 전체 조직 샘플을 포함한 다양한 샘플 유형에 대해 수행될 수 있습니다. 또한, scRNA-Seq는 세포 배양, 혈액, 및 오가노이드와 같은 다양한 생물학적 공급원에 적용될 수 있습니다.⁵

단일세포 RNA 시퀀싱을 위해 조직에서 단일세포 현탁액을 준비하려면 조직을 개별 세포로 해리해야 합니다. 이는 전형적으로 기계적 방법과 효소적 방법의 조합을 통해 달성됩니다. 가혹한 조건이 세포에 스트레스를 주고 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있으므로 세포 수율과 생존력의 균형을 맞추기 위해서는 세심한 최적화가 중요합니다.⁶

단일세포 RNA 시퀀싱은 일반적으로 신선 세포에서 실시되지만, DSP-메탄올 고정 또는 동결 세포를 사용할 수 있으나, 여기에는 한계와 함께 고려해야 할 사항이 있습니다. 동결은 세포 사멸, RNA 분해, 유전자 발현 프로파일 변경을 유발할 수 있습니다.

냉동 세포를 사용하는 경우, 냉동 및 해동 중 손상을 최소화하기 위해 적절한 배지에서 단일세포 현탁액 및 동결보존 세포로 시작하도록 권장됩니다. 냉동 조직의 경우, 해동 후 생존 세포를 해리하고 회수하는 데 따르는 어려움으로 인해 단일세포를 분리하는 것보다 단일핵 RNA 시퀀싱(snRNA-Seq)이 보통 선호됩니다.⁷

폴리아데닐화된 RNA가 있는 모든 종은 Illumina Single Cell 3' RNA Prep 키트와 함께 사용할 수 있습니다.

자세한 내용은 Illumina Single Cell 3' RNA Prep 키트의 기능과 이점을 살펴보십시오.