使用新一代测序加速CRISPR基因组编辑

新一代测序使研究人员能够完全控制整个CRISPR-Cas9基因组编辑实验

CRISPR基因组编辑和新一代测序

CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)基因组编辑是一种革命性的方法,其中的可编程RNA能将核酸酶(例如Cas9)靶向基因组中的特定位置。1,2CRISPR-Cas9技术具有突变、沉默、诱导或替换遗传元件的功能,凭借其快速、简易以及精确的优势广泛应用于世界研究领域。

整合CRISPR基因组编辑与新一代测序(NGS)的信息力,使研究人员能够完全控制整个编辑实验,从而更好地了解他们正在修饰的生物系统。

基因编辑文献综述

近期采用Illumina技术进行基因编辑的研究文献综述

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CRISPR-Cas9技术的应用已经在基础和临床研究、治疗、药物开发、农业和环境等领域得到了确认。临床研究显示,CRISPR在癌症、艾滋病、亨廷顿舞蹈症、杜氏肌肉营养不良症等疾病中具有潜在的应用价值。

CRISPR基因组编辑使研究人员能够快速、精准地创建转基因细胞系和动物模型。除了进行基因敲除和更具体的修饰外,研究人员还可使用CRISPR技术通过干扰(CRISPRi)或激活(CRISPRa)的方法调节基因表达,而不改变基因组序列(表)。

CRISPR可进行的基因组编辑类型

CRISPR基因组编辑实验得到的是混合细胞群,其中仅有一小部分细胞携带所需的编辑。研究人员需要确定哪些细胞具有所需的CRISPR敲除或靶向突变。目前评估编辑的方法包括切割分析、PCR、桑格测序和新一代测序(表)。

新一代测序是唯一一种在整个修饰范围内以高分辨率提供定性和定量信息的检测方法,能够满足任何通量的需求,并且可用于监测脱靶效应。7基于新一代测序的靶向测序通过关注靶向修饰区域,为确认CRISPR诱导的编辑提供了一种经济有效的解决方案。

深入了解靶向测序
检测基因组编辑匹配率的方法

成功实施CRISP/Cas9技术应该包括识别和减少脱靶效应(即在预期靶点以外的位点进行非预期修饰)的策略。在基因组编辑实验中,经常使用评估RNA特异性和预测脱靶位点的计算方法。

在线工具和基于网络的算法是公开可用的(表)。然而,那些可能被预测算法忽视的脱靶位点则需要全基因组分析确认,例如基于新一代测序的全基因组测序(WGS)。8

深入了解全基因组测序

筛选脱靶切割位点的全基因组方法包括细胞和体外分析法(表)。

分析脱靶效应的无偏向方法
单细胞RNA测序

筛选CRISPR修饰后的细胞群,平行确定多个基因在数以千计的单个细胞中的基因调控影响。

RNA测序

评估突变对整个转录组或基因/基因家族表达的影响。

ChIP-Seq

确定突变对DNA-蛋白结合的影响。

甲基化测序

研究突变对甲基化状态和染色质重塑的下游影响。

除了高分辨率的匹配和脱靶评估、功能验证以及对CRISPR敲除和编辑的评估外,新一代测序还可以在CRISPR基因组编辑工作流程的其他阶段整合。

在最初的设计阶段,一个基因位点或基因组的重测序(对于缺乏参考基因组的物种)有助于RNA选择。在克隆CRISPR-Cas9/向导RNA构建的过程中,对得到的质粒进行重测序,可以快速、高度可信地验证CRISPR的递送载体,特别是对于有大型质粒文库的高通量实验。

新一代测序如何适应CRISPR基因组编辑工作流程
基因组编辑播客——CRISPR-Cas9及其它

在第32集Illumina基因组学播客中,哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理学助理教授Sam Sternberg博士讨论了CRISPR和基因组编辑的生物学和影响。

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基因组编辑播客——CRISPR-Cas9及其它
农业基因组学
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由于具有简易性和低成本的特点,CRISPR-Cas9技术可将农作物的基因编辑从大宗商品扩展到更广泛的重要农业品种。

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癌症研究
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CRISPR-Cas9技术快速简易,可实现新癌症模型开发,探索新免疫治疗靶点和策略。

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CRISPR-Cas9基因组编辑的精确性可实现人类复杂疾病的细胞和动物模型开发,达到研究疾病病理学的目的。

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细胞和分子生物学研究
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CRISPR-Cas9基因组编辑凭借快速简易以及低成本的特点,为基因敲除和转基因模型开发中的细胞和分子生物学应用带来了革命性的变化。

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CRISPR-Cas9:使基因组工程变得简单
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在这段SciMon视频中,科学事务团队讨论了最近应用CRISPR-Cas9技术的一些论文

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靶向重测序和体细胞嵌合
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在这次客户访谈中,一位遗传学家讨论了新一代测序在体细胞嵌合研究中的应用,以及CRISPR技术可能的未来应用

阅读访谈录
参考文献
  1. Cong L, Ran F A, Cox D, et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science.2013;339:819-823.
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  3. Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC, Bilate AM, Ingram JR, Ploegh HL.Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining.Nat Biotechnol.2015;33:538-542.
  4. Chu VT, Weber T, Wefers B, et al.Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells.Nat Biotechnol.2015;33:543-548.
  5. Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, et al.Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.Cell.2013;152:1173-1183.
  6. Cheng AW, Wang H, Yang H, et al.Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.Cell Res.2013;23:1163-1171.
  7. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.Nat Protoc.2013;8:2281-2308.
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