신경 다양성 매핑: 생쥐 일차 시각 피질에서 뉴런 정체성의 분자 분석

소개

미국의 미래학자이자 물리학자이며 저자인 Michio Kaku에 따르면 “인간의 뇌에는 1,000억 개의 뉴런이 있으며 각 뉴런은 10,000개의 다른 뉴런과 연결되어 있습니다. 당신의 어깨 위에 있는 것은 알려진 우주에서 가장 복잡한 물체입니다.” 그의 말은 과장이 아닙니다. 실제로, 현재까지 과학자들은 인간의 뇌는 말할 것도 없고, 마우스처럼 비교적 단순한 포유류의 뇌에서도 얼마나 많은 유형의 뉴런을 발견할 수 있을지조차 알려주지 못합니다.

뇌의 내적인 작동 원리를 이해하는 데 헌신하는 독립적인 비영리 연구 기관인 Allen Institute for Brain Science는 이러한 상황을 바꾸려고 하고 있습니다. Allen Institute의 Cell Types 프로그램 연구자인 Bosiljka Tasic 박사는 마우스 시각 시스템 내에서 뉴런의 정체성을 정의하기 위해 선구적인 분자 분석 방법을 개발하고, 개별 뉴런의 전사체와 후성유전학적 환경을 분석하고 있습니다. 박사는 Allen Institute의 사명과 Illumina 시퀀싱 시스템을 사용한 단일세포 시퀀싱이 신경세포를 분류하려는 노력을 어떻게 변화시키고 있는지에 대해 iCommunity와 이야기를 나누었습니다.

질문: Allen Institute for Brain Science의 사명은 무엇인가요?

Bosiljka Tasic(BT): Allen Institute의 사명은 인간의 뇌가 어떻게 작동하는지에 대한 이해를 가속화하는 것입니다. 이러한 야심찬 사명에 기여하기 위해, 저희는 마우스 뇌를 구성하는 매우 다양한 세포 내에서 정보가 어떻게 코딩되고 처리되는지 연구하고 있습니다. 마우스는 가장 접근하기 쉬운 포유류 모델 시스템이며, 정보 처리의 많은 원칙이 포유류 사이에서 보존됩니다. 저희의 계획은 마우스 시각 시스템을 연구하여 기본 정보 처리 프레임워크를 정의한 다음, 영장류 및 인간과 비교하여 인간에게 고유한 것이 무엇인지 이해하는 것입니다.

이를 달성하기 위해서 저희 조직의 구조와 규모는 표준 학술 연구실과는 다릅니다. 저희는 다양한 전문성을 가진 많은 과학자들을 한데 모으고, 진정으로 다학제적인 방식으로 서로 중첩되는 팀으로 조직합니다. 또한, 이러한 연구의 주요 데이터를 저희 웹사이트에서 백과사전식 리소스로 커뮤니티에 제공합니다. 최신 리소스 중 하나는 이 뇌 영역을 구성하는 개별 뉴런의 유전자 발현 데이터, 생리학 및 형태를 포함하여 일차 마우스 시각 피질(V1 또는 VISp로 알려짐)의 세포 타입에 중점을 둡니다.

질문: 어떤 유형의 세포가 V1을 구성하나요?

BT: V1은 시각 정보를 처리하는 피질의 주요 영역입니다. 저희는 이 피질 영역 내에서 세포 다양성의 범위에 대한 이해가 제한적이었습니다. 저희는 흥분성 및 억제성 뉴런, 비신경세포 등 주요 유형과 각 주요 범주 내의 몇 가지 추가 하위 분류를 알고 있었습니다. 피질은 많은 사람들에 의해 연구되었지만, 단일세포 수준에서 세포 다양성을 포괄적으로 설명하고 다양한 유형의 정보를 연관지은 경우는 없었습니다. 대부분의 연구는 일반적으로 고차원 데이터 세트가 아닌 몇 가지 파라미터에 기반했습니다. 예를 들어, 세포를 분류하기 위해 3개의 유전자를 사용하면 하나의 그림을 얻을 수 있습니다. 그러나 모든 유전자를 살펴보면 매우 다른 관점을 얻을 수 있습니다.

“저희는 단일세포 mRNA 시퀀싱을 사용하여 세포당 수천 개의 유전자를 검출하고 모든 세포에 대한 고차원 데이터 세트를 얻을 수 있습니다.”

질문: 단일세포 전사체 시퀀싱이 이러한 연구에 중요한 도구인 이유는 무엇인가요?

BT: 단일세포 전사체 시퀀싱이 유리한 이유는 여러 가지가 있습니다. 이는 전장 유전체 기법으로, 하나의 세포에서 발현되는 모든 유전자를 가능한 한 최대로 분석한다는 뜻입니다. 이는 많은 유전자에 기반한 세포 다양성을 보여줍니다. 저희는 단일세포 mRNA 시퀀싱을 사용하여 세포당 수천 개의 유전자를 검출하고 모든 세포에 대한 고차원 데이터 세트를 얻을 수 있습니다. 그 전에는 사람들이 많아야 몇 개의 유전자에 기반해 세포의 특성을 규명하곤 했습니다. 우연히 핵심 유전자를 보고 있었다면, 그것만으로도 충분했을 수 있습니다. 그러나 저희는 어떤 유전자가 중요한지 알지 못했습니다.

질문: 단일세포 mRNA-Seq을 사용해 V1 신경세포에 대해 무엇을 발견하셨나요?

BT: 저희는 단일세포 mRNA-Seq 연구를 시작했을 때 무엇을 보게 될지 몰랐습니다. 저희는 우수한 시퀀싱 정보로 품질 관리 기준을 통과한 형질전환 마우스의 V1에서 약 1,700개의 세포를 수집했습니다. V1 피질 영역에서 49가지 유형을 정의할 수 있었으며, 42가지는 신경세포 유형, 7가지는 비신경세포 유형이었습니다.¹ 42가지 신경세포 유형 중 약 절반은 GABA성 뉴런인 반면, 나머지 절반은 글루탐산성 뉴런인 것으로 확인되었습니다.

이 세포 분류 분석에서 좋은 점은 편향되지 않았다는 것입니다. 이 단일세포 데이터 세트를 그룹으로 클러스터링하고 분해했을 때, 세포가 V1의 어떤 세포층과 어떤 형질전환 계통에서 유래했는지는 알지 못한 채 진행했습니다. 두 가지 병렬 클러스터링 접근법을 수행한 다음 세 번째 밸리데이션 분석을 수행하여, 저희가 밝혀낸 유전자 발현 시그니처를 바탕으로 각 단일세포를 하나의 유형으로 얼마나 견고하게 분류할 수 있는지 평가했습니다. 알려진 또는 새로운 마커 유전자에 기반하여 사후에 흥분성, 억제성 또는 비신경성 정체성 유형을 배정했습니다.

질문: ‘퍼지’라고 묘사한 클러스터를 발견했습니다. 그것은 무슨 의미이며, 그 함의는 무엇인가요?

BT: 생물정보학자들과 협력할 때, 저희 세포 타입에 대해 얻은 유전자 발현 시그니처를 살펴보고, 각 세포가 그 유형들 중 어느 것과 얼마나 잘 일치하는지 확인하고 싶었습니다. 반복적인 머신 러닝 접근법을 사용하는 이 검사는 때때로 특정 세포가 한 클러스터로 분류되기도 하고 때로는 다른 클러스터로 분류되기도 한다는 것을 보여주었습니다. 저희는 이를 ‘중간’ 세포라고 부르는데, 일반적으로 연구 논문에서 볼 수 없는 관점을 제공합니다. 이들은 모호한 정체성을 가진 세포이며, 특정 세포 타입에서 더 흔합니다. 일부 클러스터는 많은 중간 세포에 의해 ‘연결’됩니다. 다른 클러스터는 이 다차원 유전자 발현 공간에서 고유한 위치를 차지하며, 그들과 다른 클러스터 사이에 중간 세포가 없습니다.

이러한 데이터는 모든 세포 타입이 엄격하게 분리된 정체성을 갖는 것은 아님을 시사합니다. 일부 세포 타입은 명확히 구분되지 않을 수 있으며, 실제로는 표현형 연속체의 일부일 수 있습니다. 이는 신경과학에서 낯선 개념이 아닙니다. 저희는 뉴런이 활동이나 경험에 반응하여 변할 수 있고, 동물의 생애 동안 행동을 수정하는 데 필요한 가소성을 지닐 수 있다는 것을 알고 있습니다.

“NGS를 이용하여 이전에 발견되지 않았던 많은 새로운 마커를 식별했으며, 이후 다른 방법으로 그 발현을 확인했습니다.”

질문: 이전에는 전사체를 분석하기 위해 어떤 기법을 사용하셨나요?

BT: 차세대 시퀀싱(NGS)과 병행하여 qRT-PCR을 수행했습니다. 그러나 qRT-PCR의 문제는 항상 어떤 유전자를 보고 싶은지 알 수 있는 것은 아니라는 점입니다. 유전체 전반을 다루지 않는 어떤 방법이든, 문제는 유전자를 선택하는 데 엄청난 시간을 들이고도 여전히 올바른 답을 얻지 못할 수 있다는 점입니다. 사전의 유전체 전반에 대한 지식에 근거해 유전자를 선택하지 않으면, 선택이 편향되어 전사체 전체 지형을 잘 대표하지 못합니다.

mRNA-Seq은 유전체 전반의 유전자 발현 프로파일을 제공하여 전사체 지형의 구분을 가장 잘 보여주는 유전자를 구체적으로 선택할 수 있게 해줍니다. 일부 유전자는 이전에 알려져 있었지만, 현재 개별 뉴런 유형에 대한 최상의 마커로 사용하는 많은 유전자는 NGS로 식별하기 전에는 알지 못했습니다. 대신 문헌에 보고된 유전자를 사용했지만, 모든 방법에는 고유한 민감도 문제가 있어 많은 유전자가 검사되거나 검출되지 않았습니다. NGS를 이용하여 이전에 발견되지 않았던 많은 새로운 마커를 식별했으며, 이후 다른 방법으로 그 발현을 확인했습니다.

질문: 세포 분리를 어떻게 수행했나요?

BT: 세포 분리는 상당히 어려운 과제였습니다. 성인 신경계 조직은 현탁액으로 해리하기 쉽지 않기 때문에 성인의 살아 있는 뉴런을 분리하는 것은 어렵습니다. 세포는 고도로 상호 연결되어 있으며, 세포 분리 과정에서 축삭과 수상돌기가 찢어지고 많은 세포가 생존하지 못합니다. 또한 일부 희귀 세포 타입에 접근하려면 많은 세포를 프로파일링해야 합니다. 따라서 특정 세포군이 형광 단백질로 표지된 트랜스제닉 Cre 라인을 세포 소스로 사용하기로 결정했습니다. 그런 다음 성인 뇌의 세포 현탁액을 만드는 절차를 최적화하고 단일세포 분리를 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 확립했습니다. 편향되지 않은 방식으로 할 수 있는 것보다 희귀 세포 타입을 더 자주 샘플링할 수 있었기 때문에, 이 모든 작업을 통해 그러한 희귀 집단을 분리할 수 있었습니다. 따라서 저희의 세포 샘플링은 편향되지 않았지만, 잠재적으로 희귀한 세포 타입을 표지할 수 있는 트랜스제닉 라인에서 세포를 의도적으로 선택하고 분리했습니다. 이 접근법을 사용하여 매우 신뢰할 수 있는 단일세포 분리를 수행할 수 있었습니다.

BT: MiSeq 시스템으로 비교적 얕은 시퀀싱을 수행하여 랩에서 라이브러리 밸리데이션 시퀀싱을 수행했습니다. 그런 다음 HiSeq 시스템을 갖춘 여러 현지 코어 랩에 더 깊은 라이브러리 시퀀싱을 아웃소싱했습니다.

“MiSeq 시스템을 보유함으로써 방법을 신속하게 개발 및 변경할 수 있고, 코어 랩으로 보내 HiSeq 시스템에서 더 심층적인 시퀀싱을 하기 전에 좋은 라이브러리가 있는지 확인할 수 있었습니다.”

질문: MiSeq 시스템을 선택한 이유는 무엇인가요?

BT: 특히 프로세스를 개발하는 동안 라이브러리 밸리데이션을 수행하기 위해 처리 속도가 빠른 시스템이 내부적으로 필요했습니다. MiSeq 시스템을 보유함으로써 방법을 신속하게 개발 및 변경할 수 있고, 코어 랩으로 보내 HiSeq 시스템에서 더 심층적인 시퀀싱을 하기 전에 좋은 라이브러리가 있는지 확인할 수 있었습니다. 저희에게 좋은 조합이었습니다.

질문: 어떤 종류의 라이브러리 프렙 키트를 사용하고 계시나요?

BT: 저희는 여러 접근법을 테스트했으며, 단일세포에서 샘플을 안정적으로 증폭할 수 있었기 때문에 Clontech의 SMARTer를 선택했습니다. V1 연구를 위해 SMARTer 버전 1을 사용했습니다. 이제 SMART-Seq 4를 사용할 수 있으며 새로운 연구에 사용하고 있습니다. SMARTer로 얻은 cDNA에서 라이브러리를 프렙하기 위해 Nextera XT 라이브러리 프렙 키트를 사용했습니다. 이를 통해 소량의 cDNA로 NGS 라이브러리를 프렙하고 초음파 처리를 건너뛸 수 있었습니다.

“단일세포 전사체 분석을 하기 전까지는 편향되지 않은 방식으로 이질적인 조직을 채취하고 조직 내 분자 유형을 정의하는 방법이 없었습니다.”

질문: 시퀀싱 런의 파라미터는 무엇이었나요?

BT: 새로운 세포 타입을 구별하기 위한 양호한 해상도를 얻기 위해 필요한 뎁스를 알지 못했기 때문에 처음에는 시퀀싱 뎁스를 과도하게 설정했습니다. 초기 단일세포 샘플에서 cDNA를 약 2,000만~3,000만 리드까지 시퀀싱했으며, 때로는 더 높게도 했습니다. 그런 다음 리드 서브샘플링 및 클러스터링을 인실리코로 수행했으며, 대부분의 세포에서는 세포당 총 500만~1,000만 리드를 얻는 것으로 충분하다고 결정했습니다.

이러한 뎁스는 뉴런과 비뉴런, 흥분성 세포와 억제성 세포를 구별하고자 하는 경우에는 필요하지 않습니다. 이러한 연구의 경우 훨씬 더 낮은 뎁스를 사용할 수 있습니다. 세포당 100,000개 이하의 리드로 충분합니다. 그러나 저희가 얻을 수 있었던 세포 수로 관련 뉴런 아형을 구별하고 싶다면, 확실히 더 깊은 시퀀싱이 필요했습니다.

질문: 다른 접근 방식으로는 볼 수 없었지만 단일세포 시퀀싱을 통해 얻게 된 정보는 무엇인가요?

BT: 단일세포 시퀀싱은 피질뿐만 아니라 세포 타입의 분류에도 기여했습니다. 단일세포 전사체 분석을 하기 전까지는 편향되지 않은 방식으로 이질적인 조직을 채취하고 조직 내 분자 유형을 정의하는 방법이 없었습니다. 단일세포 전사체학을 사용하면 먼저 “어떤 유전자를 사용해야 하나?”라고 묻지 않고도 조직을 유형으로 분해할 수 있습니다. 대신 모든 유전자를 살펴볼 수 있습니다.

단일세포 시퀀싱 이전에는 서로 다른 세포 타입에 대한 합리적으로 포괄적인 목록이 무엇인지도 알지 못했습니다. 수천 가지 유형에 대해 이야기했을까요? 대략 어느 정도 규모였을까요? 연구 결과에 따르면 저희는 50개의 서로 다른 V1 세포 타입에 대해 이야기하고 있으며, 그중 일부는 경계가 모호할 수 있습니다. 저희의 연구가 정말로 포괄적이라고 주장할 수는 없습니다. 아마 저희가 식별하지 못한 희귀 세포 타입도 있을 것입니다. 따라서 결국 이 뇌 영역에는 수십 개가 더 있을 가능성도 있습니다.

마지막으로, 단일세포 시퀀싱을 통해 특정 세포 타입에 특이적인 마커를 정의할 수 있었습니다. 이는 이러한 특정 유형에 접근할 수 있는 도구를 구축하는 데 엄청난 의미를 갖습니다. 이제 저희는 레시피를 갖게 되었습니다. 예를 들어 유전자 A + 유전자 B는 세포 타입 Z에 대한 구체적인 접근을 가능하게 합니다. 이전에는 그저 추측만 했습니다. 이러한 새로운 도구를 통해 다양한 세포 타입의 기능을 정의하고, 신경 회로 내에서 어떻게 작동하는지 조사할 수 있습니다.

“다양한 피질 영역의 단일세포 mRNA-Seq 데이터를 비교하면 세포 타입의 보존과 고유성에 관련된 새로운 질문을 할 수 있습니다.”

질문: 연구의 다음 단계는 무엇인가요?

BT: 저희의 연구는 어떤 면에서 파일럿 연구였습니다. 연구는 잘 정의된 해부학적 영역에서 성인 피질 세포를 사용해 단일세포 mRNA-Seq을 수행할 수 있음을 보여주었습니다. 이제 다른 잘 정의된 영역, 특히 다른 피질 영역을 프로파일링하고자 합니다. 다양한 피질 영역의 단일세포 mRNA-Seq 데이터를 비교하면 세포 타입의 보존과 고유성에 관련된 새로운 질문을 할 수 있습니다.

저희는 외부 학술 랩 몇 곳과 협업하고 있으며, 이들은 자신들이 관심을 두고 있는 뇌 영역에서 세포를 분류하기 위해 저희의 접근법을 채택하고 있습니다. 이 기법을 사용하면 V1과 기능적 역할이 크게 다를 수 있는 뇌의 어떤 영역이든 분석할 수 있습니다. 특이적인 유전학적 도구를 구축함으로써, 저희가 연구하고자 하는 특정 행동에서 특정 세포 타입의 기능이 무엇인지 규명할 수 있습니다. 매우 흥미롭습니다.

MiSeq 시스템은 단종되었습니다. MiSeq i100 시스템이 권장되는 대체품입니다.  

HiSeq 2500 시스템은 단종되었습니다. NovaSeq X 시리즈가 권장되는 대체품입니다. 

단일세포 RNA 시퀀싱

Nextera XT DNA 라이브러리 프렙 키트

참고 문헌