Abstract
- Illumina 5-base 솔루션은 동시 메틸화 프로파일링 및 고정밀 유전자 변이 검출을 위한 간소화된 엔드 투 엔드 NGS 라이브러리 준비 및 분석 워크플로우를 제공합니다.
- Illumina-조작 효소는 메틸화되지 않은 시토신을 보존하면서 메틸화 시토신(5mC)을 티민으로 변환하는 데 사용되며, 이는 정렬을 극대화하고 각 시퀀싱 리드로부터 A, G, C, T, 및 5mC의 5-base 리드아웃을 가능하게 합니다.
- 워크플로우는 1일 미만의 라이브러리 준비 후 1시간 이내에 표준 Illumina 시퀀싱 및 초고속 DRAGEN 이중 오믹스 이차 분석으로 구성되며 표적 인리치먼트와 호환됩니다.
- 초기 테스트 결과, Illumina 5-base 솔루션은 시판 중인 메틸화 기술과 동일한 정확도로 메틸화 프로파일링을 제공하고 동시에 고정밀 유전자 변이 검출을 제공합니다.
소개
DNA 분자는 유전적 서열 및 후성유전적 변형을 포함한 여러 층의 정보를 함유하여 본질적으로 다중체가 됩니다. 4개의 정규 뉴클레오티드 이외에, 다섯 번째 염기가 있습니다: 메틸화 시토신(그림 1). 메틸화 시토신은 환경, 발달 및 세포 인자에 반응하여 유전자 발현을 변형시키는 동적 분자 신호로서 작용하는 후성유전학적 태그입니다. 유전자 변이가 건강 상태에 대한 인사이트를 제공하는 것과 마찬가지로, 비정상적인 메틸화 시그니처는 질병의 지표 역할을 할 수 있습니다. 유전 및 후성유전학 정보를 함께 계층화하면 단일 오믹스 연구에만 의존하는 것에 비해 해상도와 민감도를 향상시켜 새로운 생물학적 인사이트를 얻을 수 있습니다.
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그림 1: DNA 분자는 A, C, G, T 및 메틸화 C의 5개 염기로 구성됩니다.
중아황산염 또는 EM-seq와 같은 상업적으로 이용 가능한 메틸화 프로파일링 방법은 비메틸화 시토신을 티민으로 변환하여 라이브러리로부터 대부분의 시토신을 제거하고 시퀀싱하고 정렬하기 어려운 저복잡성 유전체를 생성합니다. 그런 다음, 메틸화된 시토신을 나머지 전환되지 않은 시토신으로부터 추론합니다. 이러한 기술은 DNA 메틸화에 대한 현재의 이해를 형성하는 데 있어 기본 도구였지만, 고해상도 유전자 변이 검출을 가능하게 하는 데에도 충분한 정확도가 부족합니다. 우리는 동일한 워크플로우에서 두 가지 변이 유형을 모두 감지하는 솔루션이 발견을 크게 가속화할 것이라고 생각했습니다.
이러한 맥락에서, 대체 접근법과 비교하여 빠르고 간단하며 포괄적인 워크플로우에서 메틸화 프로파일링 및 유전자 변이 검출을 가능하게 하는 혁신적인 5-base 솔루션을 소개합니다(그림 2).
그림 2: Illumina 5-base 솔루션은 대체 메틸화 프로파일링 또는 이중 오믹스 라이브러리 준비 및 분석 옵션에 비해 작업 시간이 더 짧습니다.
1. Dual-omic on-market: Füllgrabe et al. 2023; On-market enzymatic: Vaisvila et al. 2021 (library prep) and Bismark; Bisulfite: xGen Methyl-Seq DNA Library Prep Kit (assessed March 2025); WGS: Illumina DNA Prep and DRAGEN pre-sequencing steps include quantification, normalization, and pooling
새로운 솔루션
Illumina 5-base 용액의 핵심에는 메틸화 시토신을 시퀀서 준비 티민으로 선택적으로 직접 전환하기 위해 Illumina에서 자체적으로 조작된 새로운 맞춤형 효소가 있습니다(그림 3). 수백만 개의 단백질 변이를 반복 세대에 걸쳐 스크리닝하여, 메틸화 시토신에 대한 선택도가 가장 높은 단백질을 식별하고, 반응이 단 30분 내에 최적으로 수행되도록 효율을 확인했습니다.
그림 3: 메틸화 시토신(5mC)을 티민으로 매우 선택적으로 전환하도록 조작된 새로운 효소
그림 4: 메틸화된 C 대 C>T 변이는 DNA 이중체에서 분리됩니다.
작동 방법
메틸 시토신 전환 반응은 고효율 결찰 기반 라이브러리 준비 워크플로우 내에서 간단하고 통합된 단계입니다. 워크플로우는 추출되고 전단된 유전체 DNA(gDNA) 또는 무세포 DNA(cfDNA)로 시작하여 최종 복구, A-테일링 및 어댑터 결찰을 거칩니다. 다음으로, DNA를 변성시키고 5-메틸 시토신 전환 효소와 함께 인큐베이션하여 메틸화 시토신을 1시간 이내에 단일 반응에서 직접 전환시킵니다. 변환 후, 샘플을 PCR로 증폭하고 표준 lllumina 염기서열분석 플랫폼에서 염기서열분석을 위해 비드를 정제합니다. 라이브러리 준비는 매우 간소화되어 있으며 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 변환 화학은 또한 UMI 기반 오류 수정을 포함한 심층 애플리케이션을 위한 표적 캡처 인리치먼트와도 호환됩니다.
시퀀싱이 완료되면, 정렬, 메틸화 주석, 및 변이 검출은 단 1시간 만에 단일 푸시 버튼 분석 파이프라인으로 수행될 수 있습니다. 결과는 Illumina Connected Multiomics 및 Emedgene과 같은 해석 소프트웨어로 추가로 처리할 수 있습니다.
그림 5: 5-base 워크플로우
시퀀싱이 적은 고정밀 메틸화 프로파일링
벤치마킹 연구에서 5-base 솔루션은 골드 스탠다드 메틸화 변환 방법과 유사한 정확도로 메틸화 프로파일링을 제공합니다. chemistry는 메틸화 및 비메틸화 pUC 및 람다 컨트롤 유전체를 사용한 평가에 기초하여 메틸화 시토신의 높은 전환 속도 및 비메틸화 시토신의 매우 낮은 오프-타깃 전환을 달성합니다(그림 6A). 인간 유전체에서 CpG 섬에 걸쳐 5-base 솔루션으로 측정한 메틸화 수준은 EM-seq 변환으로부터 수득된 값과 매우 일치합니다. 메틸화된 시토신만 변환함으로써 5-base 라이브러리의 매핑 가능성이 높아지면 시퀀싱 뎁스당 더 많은 CpG 부위가 커버되므로(그림 6C), 5-base 솔루션을 사용한 발견 역량이 향상됩니다.
그림 6: 시판 중인 골드 스탠다드 methyl-seq 화학 물질에 비해 시퀀싱 리드가 적은 고정밀 메틸화 검출
(A) Illumina 5-base 용액은 메틸화 대조 DNA(비메틸화 람다: 0.5%, 0.4%, 0.9%; 메틸화 pUC19: 95.0%, 96.4%, 94.7% 중아황산염, EM-seq v1, Illumina 라이게이션 기반 라이브러리 준비로 수행된 5-base 전환 방법) (B) Illumina 5-base는 NA12878 참조 DNA의 CpG 섬에서의 평균 메틸화를 비교할 때 EM-seq와 높은 상관관계를 갖습니다 (C) Illumina 5-base 대 EM-seq v1 전환을 사용한 5억 개의 시퀀싱된 리드 쌍으로부터 포획된 CpG의 수. 2,700만 개의 CpG 부위는 EM-seq를 사용한 2,200만 개의 CpG와 비교하여 5-base를 갖는 10배 커버리지를 갖습니다.
고감도 유전 변이 동시 검출
비메틸화 시토신을 티민으로 전환하는 메틸화 chemistry는 유전자 변이 검출에 어려움을 초래하며, 일반적으로 유전자 변이 정보가 필요한 경우 표준 시퀀싱 라이브러리를 별도로 처리해야 합니다. Illumina 5-base 솔루션은 동일한 시퀀싱 리드 내에서 메틸화 시토신 검출 외에 4개의 염기 위치(A, T, G, C) 모두에서 고해상도 변이 검출을 가능하게 함으로써 2개의 별도 라이브러리 준비가 필요하지 않습니다. Illumina BaseSpace Sequencing Hub 또는 Illumina Connected Analytics에서 사용할 수 있는 DRAGEN 애플리케이션으로 분석할 때, 5-base 솔루션은 생식세포 및 체세포 변이 모두에 대해 고정밀 소형 변이 검출을 제공합니다(그림 7A, 7B). 또한, 이 기술은 혈액, 신선 동결 조직, 또는 cfDNA로부터의 저주파 변이체를 검출하기 위해 표적화된 캡처 인리치먼트와 조합될 수 있습니다(그림 7B).
그림 7: DNA 변이 검출 성능은 표준 WGS와 유사합니다.
(A) NA12878용 Illumina 5-base 솔루션(Bis-SNP에 의해 처리된 EM-seq 및 중아황산염, DRAGEN에 의해 처리된 5-base 및 WGS)의 생식세포 SNV 검출 정확도는 WGS와 유사합니다. (B) 표준 WGS 대비 인리치먼트 및 UMI 통합을 통한 낮은 변이 대립유전자 빈도(VAF) SNV 검출
듀얼 오믹스 인사이트를 갖춘 하나의 assay로 발견 가능
Illumina 5-base 솔루션은 단일 워크플로우에서 얻은 유전적 및 후성유전학적 인사이트를 활용하기 위한 새로운 접근법으로, 암 및 희귀 질환을 포함한 광범위한 연구 응용 분야에서 발견 역량을 향상시킬 것으로 예상됩니다. 단일 판독에서 게놈 및 메틸놈 상태의 동시 보고는 병원성 돌연변이를 생식선 대립유전자 특이적 메틸화에 연결하는 데 활용될 수 있습니다(그림 8A). 또한, 5-base가 단일 샘플 제조 (그림 8B)로부터 수득된 게놈 및 메틸화 시그니처의 듀얼-오믹스 조사에 의해 사례를 해결한다는 것을 입증합니다. Illumina는 듀얼-오믹스 인사이트를 결합하여 다양한 흥미로운 응용 분야에서 새로운 발견을 이끌어내는 방법을 지속적으로 탐구하고 있습니다. 5-base 솔루션은 2026년 초에 시판될 것으로 예상됩니다.
그림 8: 멀티오믹스 인사이트로 해결 능력 향상 및 발견 역량 강화
(A) 유전체 및 메틸롬의 동시 리드 수준 보고는 하나의 대립유전자 상에서 생식세포 대립유전자 특이적 메틸화를 포획합니다. 다른 대립유전자에서 미스센스 돌연변이 및 메틸화 부재가 관찰되며, 이는 표준 WGS 단독에 의해 해결될 수 없는 시그니처입니다. (B) 5-base 기술을 사용하는 희귀 질환 연구 참여자의 DNA 샘플 처리. Illumina DRAGEN 생식세포 분석을 통한 작은 변이 검출은 KMT2D 돌연변이를 식별했습니다. 메틸화 데이터는 EpiSign이 개발한 후성유전학적 질병 분류 알고리즘을 통해 처리되었습니다. 종합해 볼 때, 돌연변이와 후성유전학적 특징은 이 질병을 가부키 증후군으로 분류합니다.